Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales

摘要: En esta Tesis Doctoral se propone una alternativa a la coyuntura actual de rechazo social frente al uso OMG en industria agroalimentaria, mediante demostracion y el desarrollo un nuevo concepto sobre las tecnicas biologia molecular obtencion levaduras modificadas geneticamente, Evolucion Genomica por Diseno Molecular. La idea basica este es simple basa imitar propia naturaleza su constante evolucion, pero acelerando dirigiendo proceso evolutivo con objeto seleccionar corto periodo tiempo aquellos cambios geneticos que especificamente hayamos disenado escala molecular. Las no son entidad invariable tiempo, contrario, como todos los organismos vivos evolucionan lo largo sucesivas generaciones. Mediante nueva metodologia hemos desarrollado, consigue acelerar evolutivo, pues modificaciones geneticas introducido podrian haber efectuado espontaneamente levadura entorno natural consecuencia procesos recombinacion, duplicacion o eliminacion elementos ciclo reproductivo, aunque indudablemente habrian perdido sin presencia determinadas condiciones seleccion y, dada baja probabilidad esos eventos ocurrieran, necesitado inmenso tiempo. Se ha demostrado Molecular, construccion e integracion cromosomica casete basado sobreexpresion del gen YAP1, da origen marcador dominante confiere resistencia diversos compuestos toxicos para levaduras, tales cicloheximida cerulenina. Para dicho nos impuesto respetado siguientes condiciones: 1) Utilizacion capacidad recombinacion homologa genero Saccharomyces. 2) material genetico procedente exclusivamente cepa evolucionar. 3) El sufrir ningun paso intermedio clonaje expresion otros sistemas biologicos. Una vez cumplidas todas estas condiciones, cepas resultantes deberian responder definicion oficial modificados geneticamente Union Europea: ?organismos sido alterado manera sucede forma reproduccion sexual y/o natural?. alcanzar objetivo fundamental proyecto, trabajado inicialmente sistema modelo mas sencillo, caso laboratorio continuacion, abordado misma aproximacion experimental trabajando emplea produccion industrial cerveza tipo ?lager?. empleado consistido obtener, solo reacciones PCR, que, posteriormente insercion homologa, pone YAP1 bajo control promotor fuerte ruta glicolisis, PGK1. determino si levaduea cervecera evolucionada, era capaz disminuir aparicion espontanea mutantes deficientes respiracion (?petites?) durante fermentacion mosto cervecero. continuada reutilizacion asociada incremento frecuencia ?petites?, consiguiente efecto negativo fermentativo. Segun resultados obtenidos, presenta claramente menor formacion ?petites? 10 microfermentaciones sucesivas, respecto parental. demostrada viabilidad siguiente consistio aplicacion dicha mejores caracteristicas interes industrial. han reorganizaciones cromosomicas 3 tipos industriales: a) tipo? lager? evolucionada dar lugar diacetilo, fenotipo buscado obtenido ILV5, codifica isomerorreductasa convierte ?-acetolactato ?-s-dihidroxivalerato. De forma, evita acumulacion acorta sensiblemente maduracion haberse reducido diacetilo. dias parental necesario concentracion diacetilo nivel practica considera aceptable finalizado ?lagering?. b) aumentado notablemente actividad pectinolitica, aplicaciones procesado vegetal rico pectina; PGU1 endopoligalacturonasa. obtuvieron dos nuevas variantes parental, conteniendo otra elimino denominado ?pop out?, permitiendo sucesivos disenos reordenacion genomica cepa. Ambas presentan notable hidrolitica pectina perjuicio etanol ni fermentativa. c) vinica comercial evolucionado busca mejor tolerancia bajas temperaturas. intentado obtener deseado inactivacion INP51 enzima inositol polifosfato 5-fosfatasa, implicada homeostasis 4, 5-difosfato, cuya perdida funcion provoca metabolito segun descrito literatura, aumento frio. inactivado bien copia industrial, ambas copias. Sin embargo, contrariamente laboratorio, aumenta crecimiento temperaturas evolucionada. Todos estos ejemplos desarrollada demuestran utilidad Molecular mejora industriales