Caracterización Genética y Funcional de la Proteína ns P1a/4 de Astrovirus Humano

摘要: Los astrovirus humanos son virus de gastroenteritis infantiles y tienen un genoma RNA monocatenario polaridad positiva organizado en tres pautas abiertas lectura (ORF1a ORF1b para las proteinas no estructurales, ORF2 estructurales). Actualmente se desconoce la funcion muchas sus estructurales. No obstante, region C-terminal poliproteina nsP1a codificada por el ORF1a (denominada nsP1a/4) han descrito multitud motivos que podrian tener una biologica relevante su ciclo replicativo. Entre otros, cabe destacar presencia hipervariable (HVR), ha relacionado con posible papel replicacion del virico, putativa codificante proteina VPg. Bajo estas premisas los objetivos esta tesis fueron profundizar caracterizacion nsP1a/4 tanto a nivel variabilidad genetica como funcional confirmar experimentalmente existencia VPg unida covalentemente al virico. El analisis HVR mostro grado elevado variabilidad, sobre todo aminoacidos, buena tolerancia inserciones deleciones cambios sinonimos. Por otro lado, filogenetico 104 aislados permitio identificacion 12 genotipos diferentes carga virica excretada muestras clinicas correspondientes distintos derivados correlacion significativa entre estos dos parametros. Aprovechando astrovirus, desarrollo tambien metodo tipado molecular amplificacion RT-PCR polimorfismo longitud fragmentos restriccion (RFLP). Con fin establecer posibles diferencias funcionales genotipos, clonaron expresaron sistema baculovirus varias formas IV, V, VI XII. Asi, todos estudiados, observo existen isoformas proteina, isoforma fosforilada fosforiladas, fosforiladas interaccionan si formando oligomeros. Ademas, dada implicacion proceso RNA, estudio potencial interaccion polimerasa virica. Para interacciona heterodimero. En cuanto forma polimerasa, resultados mostraron lo hacen fosforilada, bien este caso observaron genotipos. Concretamente, correspondiente genotipo presento patron mas fuerte comparacion fosforilada. VPg, co-purificadas revelo peso (13-15 kDa) compatible predicha computacionalmente. La peptido 15 aminoacidos confirmo localiza dentro tratamiento proteolitico Proteinasa K demostro dicha resulta esencial infectividad virus. Finalmente, uso distintas mutadas identificar residuo Tyr693 union RNA. Asi pues, mejor proporciona bases aplicacion futuro nuevas dianas antiviricas.