Characterization of growth and differentiation of a spontaneously immortalized keratinocyte cell line (HaCaT) in a defined, serum-free culture system

摘要: HaCaT Zellen sind humane, spontan immortalisierte Keratinozyten, die bisher nur in serumhaltigem Medium kultiviert und charakterisiert wurden. In dieser Arbeit ist es gelungen, serumfreiem MCDB 153-Medium mit Zusatzen zu etablieren. wurden hinsichtlich Proliferations- Differenzierungskriterien analysiert Normalen Humanen Keratinozyten (NHK) verglichen. Die Methoden Zellzahlbestimmung, Durchfluszytometrie, klonaler Wachstumsassay, Bromodeoxyuridine (BrdU)-Inkorporation, Apoptoseassay, Northernblot- Analyse, metabolische Markierung Transfektion hierzu drei verschiedenen Projekten eingesetzt. Im Kompletten (KM) epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), Insulin bovinem Hypophysenextrakt betrug Zellgenerationszeit 26 Stunden. 90% aller befanden sich im Wachstumspool, wie durch Langzeit-BrdU-Markierung gezeigt werden konnte. Nach Entzug der exogenen Wachstumsfaktoren (WF) 40 Stunden, das Wachstum ging schnell zuruck entstanden apoptotischen Merkmalen. 9 Tagen ohne WF weniger als 5% S-Phase des Zell-zyklus. Durch Zusatz von EGF oder wurde ahnlich KM stimuliert. Eine Erhohung Kalziumkonzentration auf 1.5 mM Kulturmedium (mit exogene WF) hatte keinen Einflus Wachstumsverhalten, fuhrte jedoch einer erhohten Adhasion Zellen. Gegensatz NHK exprimierten fruhen Differenzierungsmarker Keratin 1 (K1), 10 (K10) Involucrin. Ein groser Teil verlor Eigenschaft, Zellklone bilden leitete somit terminale Differenzierung bereits unter subkonfluenten Wachstumsbedingungen ein. supprimierte K1, K10 Involucrin mRNA-Expression konfluenten Zellkulturen. Bei K1 Zellkulturen KM. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, konnen, wobei sie viele Wachstums- Differenzierungseigenschaften beibehalten. Allerdings Vergleich starker abhangig, denn deren resultiert einem Wachstumsruckgang, Expression Differenzierungsmarkern dem Auftreten Dadurch Sinne In-Vitro-Mehrstadien-Tumorgenese Initiationsstadium eingestuft. Auswirkung Tumor-Promotors 12-o-tetradecanoyl-13-acetat (TPA) weiteren untersucht. zum zellwachstumsinhibierenden Effekt TPA den BrdU- Markierungsindex erhohte klonale Wachstumspotential konnte nicht steigern, auch hier Wachstumspotential. Somit konnten zumindest einige nach ihr proliferatives Potential erhalten. daruber hinaus WF. Diese Ergebnisse zeigen, Ansprechverhalten unterscheiden. verhinderte Einleitung terminalen einigen jun fos aus Activator Protein (AP-1) Familie Transkriptionsfaktoren regulieren Gene, wahrend Wachstums, Tumor-Progression exprimiert werden. dominant-negativen Deletionskonstrukt c-jun (Transactivation domain mutant 67 (TAM 67)) transfiziert. Zellreihe pmm genannt. Als Kontrollzellreihe dienten Zellen, neo-Vektor transfiziert (neo HaCaT). TAM 67-Proteinexpression nachgewiesen. Viele Differenzierungs-kriterien waren denen Kontroll-zellreihe neo vergleichbar. zur bei Subkonfluenz unterdrucken. deuten an, wahrscheinlich an Wachstumsregulation, sowie K1- K10-Expression beteiligt ist. Wahrscheinlich spielt TPA-mediierten Suppression eine wichtige Rolle.