Exploring the therapeutic potential of recombinant AAV vectors in stem cell and transplantation model systems for the treatment of heart diseases

摘要: Herzerkrankungen sind weltweit die Hauptursache fur einen vorzeitigen Tod. Sowohl Gentransfer als auch zellulare Therapien werden derzeit neue Behandlungsmoglichkeiten diese Erkrankungen entwickelt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte der AAV-vermittelte von Transgenen ins Herzgewebe Donororganen, anschliesend transplantiert wurden, etabliert werden. Als Tiermodelle heterotopen Herztransplantationen wurden Sprague Dawley Ratten und Deutsche Landrasseschweine gewahlt. rAAV2, welcher diesen Zweck geeignet beschrieben wurde, wurde intracoronar entweder in das normotherme oder hypotherme Herz appliziert, welches eine Empfangerratte wurde. Der erfolgte mit einer besseren Effizienz Herzen. Trotz des erfolgreichen Transfers Nachweisbarkeit Vektor-DNA Gewebeproben 28 Tage nach Transplantation konnte jedoch weder Transgen-spezifische mRNA noch Proteinexpression detektiert Zur Bestimmung potentieller Barrieren, welche rAAV2-vermittelte Transgenexpression unserem Rattenmodell beeintrachtigen, vitro Analysen Rattenaortenendothelzellen durchgefuhrt. Wir konnten Zelleintritt intrazellulares trafficking viralen Partikel ebenso inhibierende Faktoren ausschliesen wie Expression vom gewahlten CMV Promotor. Die signifikante Erhohung AAV1 (der effizienteste Serotyp) AAV2 Applikation Proteasomeninhibitors MG132 deutet auf Blockierung Vektordegradation hin. Daruberhinaus indirekte Effekte erhohte Ubiquitinierung Vektorkapsids denkbar, man annimmt, dass sie sogenannte vector uncoating Translokation den Nucleus erleichtert. Des Weiteren geringfugig eingeschrankte Fahigkeit zur Zweitstrangsynthese beobachtet Diese wird benotigt, um einzelstrangige DNA-Genom herkommlich verwendeter AAV-Vektoren transkribierbaren Doppelstrang zu verwandeln. Zusammenfassend muss feststellen, sich analysierten rAAV Serotypen ungeeignete Gentransfervektoren Rattenendothelzellen erwiesen haben. Gegensatz dazu primaren Rattencardiomyocyten deutlich hohere Transduktionseffizienz erzielt. Um vivo sowohl Endothelzellen Cardiomyocyten transduzieren verwendeten wir vasoaktive Substanz Histamin porcinen Transplantationsmodell. durch Versuche ermittelte Serotyp 2 unter Verwendung neuentwickelten situ Langendorff Reperfusionssystems zusammen appliziert. In beiden Tieren Nachweis eines Gentransfers anhand messbarer Transgen-DNA-Mengen erbracht einem Tiere zudem funktionales Protein nachgewiesen. Dieses Schwein hatte zehnmal Vektormengen erhalten. Dieser Vektor kodierte Transgen Luciferase wies self-complementary (Pseudo-Doppelstrang) Vektorgenom-Konformation auf. Schwein, keine zeigte, behandelt, beta-Galaktosidase Einzelstrang-Vektorgenom-Konformation kodierte. Obwohl weitere Experimente Einflusses drei Parameter (Vektormenge, Wahl Transgens), einzeln Kombination, benotigt werden, zeigen, ein rAAV2-vermittelter porcines im Rahmen (Xeno-) Transplantationsansatzes Prinzip moglich ist. zweiten meiner Protokoll effizienten Transduktion humaner CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut etabliert. Derartige Protokolle ermoglichen Kombination Zell- Gentherapie, breites Spektrum an Anwendungen vorteilhaft Vergleiche 2, 3 5 ermittelten rAAV2 effizientesten Transgenexpression. war abhangig Heparansulfatproteoglycan alpha-5-beta-1 Integrin. ist Synthese Zweitstrangs beeintrachtigt, da nur Zugabe Vektoren Genomen Konformation Transduktionen resultierte. ohnehin schon sehr effiziente vorexpandierter signifikant all-trans Retinsaure dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Trichostatin A erhoht weisen unsere Ergebnisse darauf hin, nicht endothelialen Differenzierung interferieren. kann festgestellt etablierten Protokolls effizient transduziert konnen somit geeignetes Vektorsystem transienten Modifikation anbietet.