Untersuchungen zur Expression der Ac-Transposase aus Mais (Zea mays L.) in Gerste (Hordeum vulgare L.)

摘要: Die vorliegende Arbeit hat die Aktivitat von Ac-Transposase aus Mais (Zea mays L.) im heterologen System Gerste (Hordeum vulgare Rahmen der Etablierung eines ‚Transposon-Tagging’-Systems zur Insertionsmutagenese analysiert und charakterisiert. Transponierbare Elemente sind bewegliche funktionelle Einheiten des Genoms. Fur Transposition brauchen transponierbare eine trans-aktive Transposase sowie cis-determinante ‚Terminal Inverted Repeats’ (TIR) subterminale Sequenzmotive. Wahrend interagiert mit den cis-Determinanten transponierbaren Elements. Der teilweise Verlust fuhrt Immobilisierung Elements (Healy et al. 1993). Als Ausgangsmaterial Gerstenlinien verwendet worden, mittels Partikelbeschuss immobilisierten Elementen cwAc, cwAc103-807 UbiAc transformiert worden waren. Die cwAc durch Deletion ersten funf Basen 5’-TIR Ac abgeleitet. Das Element enthalt zusatzlich gegenuber dem Ac-Wildtyp-Element 412 Basenpaaren 5’-UTL (Kunze 1995) exprimiert N-terminal um 102 Aminosauren verkurzte Transposase. UbiAc-Konstrukt (Koprek 1999) unter Kontrolle Ubiquitin1-Promotors (Christensen 1992). Neben Untersuchung auf Diploiditat (3.1), vollstandige Integration Kopienanzahl Transformationskonstrukte (3.2) ist Expression, insbesondere Prozessierung Ac-Transkripten (3.3) Ac-Transposase-Aktivitat (3.4), in stabil transformierten (3.1) untersucht worden. Expression funktionsfahiger notwendig, dass Genort das intakte Gen einschlieslich Promotors Polyadenylierungssignals enthalt. Die per Mikrosporenkultur doppelhaploidisierten Durchflusszytometrie, PCR Southern-Blot uber mehrere Generationen Vererbung Ac-Elements beobachtet Alle Linien diploid enthalten mindestens ein vollstandiges immobilisiertes Ac-Element. Bei einigen tritt jedoch Segregation Ac-Elemente auf, was darauf hinweist, Doppelhaploidisierung nicht bei allen erfolgreich gewesen ist. Ac-Transkripte Maislinie P1-vv::Ac RT-PCR isoliert, kloniert sequenziert untersuchten Gerstenpflanzen produzieren korrekt gespleiste Ac-Transkripte alternativ Transkripte, herausgespleiste Sequenzen Exon 2 3 aufweisen. herausgespleisten beginnen jeweils gleichen Donorspleisstelle Position 1581 bzw. 2729 enden unterschiedlichen Akzeptorspleisstellen. Solche alternativen Transkripte auch dikotylen Pflanzen wie Arabidopsis thaliana bekannt (Jarvis 1997, Martin 1997). Auch treten auf. Vermutlich reduziert alternative Spleisen Menge Verfugung stehenden funktionellen Ac-Transposasemolekule Zelle. In einem eigens dafur entwickelten semi-transienten Testsystem Plasmid pUbi::mDs::GUS Gerstenskutellum-Gewebe variable Transposase-Aktivitaten vitro nachgewiesen nimmt bis zu sechs Ac-Kopien steigender Dosis einer hoheren Anzahl wieder ab. In homozygoten heterozygoten Linie, vier unabhangige Ac-Elementkopien enthalt, kann werden, Ac-Aktivitat Ac-Elementen Genom zunimmt. mehr ab. Moglicherweise Ursache fur Autosuppression Spleisen, da dieses auser 1997) Ursprungsorganismus auftritt, sondern Bildung Ac-Transposase-Aggregaten. Weder verwendete Promotor noch haben einen direkten Einfluss Gerste. genetische Umgebung einzelnen Ac-Loci beeinflusst Ac, mehreren unterschiedlich aktiven Loci gezeigt ist. Es hoher bestimmt bereits Kreuzungsversuche wurden (Lazarow 2006). ‚Transposon-Tagging’-System damit etabliert einsatzbereit. The purpose of this work is to analyse and characterize the activity Ac-transposase from maize heterologous organism barley order establish a Transposon-Tagging system for insertional mutagenesis barley. Transposable elements are mobile functional units genome. Transposons require trans-activating protein transposase cis-determinant ‘Terminal as well subterminal sequence motives transposition. During transposition interacts with cis-determining sequences. The partial deletion sequences leads immobilisation transposable element 1993). Barley lines transformed immobilised via particle bombardment have been analysed. derived by first five bases 5’-TIR. basepairs additionally deleted 5’-leader cwAc103-807. codes truncated lacking aminoacids at N-terminus. UbiAc-construct contains under control Ubiquitin1-promoter 1992). The transgenic tested diploidity their genomes complete integration number inserted constructs (3.2), expression transposase. Attention focused on processing transcripts Ac-transposase-activity (3.4) stably lines. containing an intact transposase-gene including promoter poly adenylation site vital Ac-transposase. Homozygous generated microspore culture analysed flow-cytometry, Southern-blotting over several generations. All contain least one Ac-element. transgene detected some lines, suggesting that not all double-haploid. Ac-transcripts isolated sequenced line P1-vv::Ac. produce correctly spliced Ac-transcripts alternatively exons 3. begin same splice donor position or end different acceptor sites. Similar previously dicotyledoneus Alternatively can also be maize. Alternative splicing probably reduces amount available cell. Variable transposase-activity has demonstrated specially designed semi-transient test plasmid pUbi::mDs::GUS. increases Ac-dosage. In maximum reached six Ac-copies Homo- heterozygous individuals up four independent Ac-elements show Ac-copies. Probably cause auto-suppression splicing, it occurs 1997), but aggregation transposase-protein cell. Neither usage nor seem direct effect barley. genetic environment Ac-loci influences shown loci. Several high Ac-activity identified already being used breeding-experiments Hereby Ac-based successfully established.